Дентальная имплантация является одним из вариантов замещения дефектов зубного ряда и в последние годы благодаря своим преимуществам стает все более распространенным стоматологическим вмешательством. Важными аспектами после хирургического вмешательства является достижение и поддержка остеоинтеграции, а также формирование связи между эпителием десен и поверхностью имплантата. Сама идея остеоинтеграции впервые появились в 1970-1980 гг. Сама по себе остеоинтеграция представляет собой структурно-функциональное слияние поверхности имплантата с окружающей костной тканью. Тесный контакт тканей десны с шейкой инфраконструкции помогает предотвратить риск бактериальной колонизации, которая провоцирует периимплантит. Непосредственная связь мягких тканей с поверхностью титана, напротив, создает условия для костного биомеханического укрепления интраоссального юнита. Первичная стабильность является первым и одним из важнейших аспектов для достижения остеоинтеграции и определяется качеством механической фиксации, дизайном самой конструкции и структурой костной ткани. На микроскопическом уровне дизайн винта, форма и шаг резьбы являются основополагающими факторами, влияющими на стабильность дентальных имплантатов. Abuhussen и коллеги пришли к выводу, что дизайн имплантата должен максимизировать распределение напряжений и в то же время минимизировать действие неблагоприятных стрессовых сил вдоль границы контакта кости с имплантатом. Меньший шаг резьбы, углубление витков и больший размер самой конструкции помогают увеличить площадь контакта поверхности имплантата с окружающей костной тканью.
Несколько исследований пытались оценить взаимодействия имплантата и кости при различных модификациях поверхности интраоссального винта. Так, например Variola и коллеги отметили значение микроизменений поверхности имплантата как фактора влияющего на миграцию и дифференциацию клеток-предшественников, что, в свою очередь, определяет процесс ремоделирования окружающей костной ткани. Некоторые исследователи доказали, что шероховатость поверхности способствует остеоинтеграции путем улучшения миграции клеток и повышения уровня их адгезии. Однако другие исследования докали еще и не менее важную роль микроскопических особенностей поверхности имплантата, определяющих особенности формирования костной ткани в месте контакта с имплантатом. Поэтому данный фактор является тоже косвенно влияющим на процесс остеоинтеграции. Однако, объективный контроль влияния поверхностных модификаций на изменения уровней протеинов и клеточных дифференциаций (то есть в нанометровом диапазоне) является довольно сложной задачей как для исследователей, так и для самих производителей дентальных имплантатов.
Нанотехнологии, по своему определению, направлены на «создание функциональных материалов, устройств и систем путем работы с веществом в нанометровом диапазоне (1-100 нм) с использованием новых свойств материалов (физических, химических, биологических), характерных для данных параметров вещества» (согласно дефиниции Национального управления аэронавтики и исследования космического пространства). Сам же термин «нанотехнологии» впервые предложил Норио Танигучи из Научного Университета Токио в 1974 г., который определил его следующим образом: «Нанотехнологии в основном базируются на обработке, разделении, консолидации и деформации вещества на уровне одного атома или одной молекулы, что предусматривает работу с частицами материалов в диапазоне от 1 до 100 (10-9) нм. Исходя из этого, материалы по их форме и структуре можно классифицировать как наноструктуры, нанокристаллы, нанопокрытия, наночастицы и нановолокна».
С помощью нанотехнологий можно создать поверхность имплантата с контролируемыми специфическими особенностями топографии и химического состава, которые помогут понять характер биологических взаимодействий субстратов, и, таким образом, способствуют разработке новых модификаций с предсказуемыми интеграционными характеристиками. Применение нанотехнологий при разработке биомедицинских поверхностей аргументировано способностью клеток к взаимодействию с нанометрическим рельефом посредством интегринов, которые, в свою очередь, обеспечивают связь с аргинин-глицин-аспартатной последовательностью пептидов. Клеточная адгезия к экстрацелюлярному матриксу (ЭЦМ) инициирует кластеризацию интегринов и образование фокальных интегриновых адгезивных комплексов (ФИАК), которые активируют целый каскад внутриклеточных сигнальных реакций. Нанотехнологии также решающим образом могут влиять на поведение и дифференциацию стволовых клеток. Остеобласты способны повторять трехмерные характеристики поверхности (линии, поры или точки) и при этом модулировать прирост кости в соответствии со структурными особенностями поверхности, на которую они мигрировали. Таким образом, структура поверхности играет одну из ключевых ролей в ходе приживания имплантата.
В последнее время также было разработано несколько новых технологий покрытия с нанесением гидроксиапатита и фосфатов кальция (CаP) на поверхность имплантатов. Было доказано, что СаР покрытие обеспечивает остеокондуктивные свойства поверхности имплантата, так как после имплантации кальций-фосфорные соединения подвергаются растворению в периимплантатной области, что, в свою очередь, увеличивает силу ионных взаимодействий и уровень насыщенности крови в области вмешательства. Данный процесс приводит к осаждению биологических нанокристаллов апатита на поверхности имплантата, что также предусматривает преципитацию протеинов и клеток-предшественников, которые благодаря своему содействию обеспечивают формирование экстрацелюлярного матрикса костной ткани. В ходе исследований также было продемонстрировано, что остеокласты способны разрушать структуру кальций-фосфорного покрытия поверхности посредством ферментов, создавая при этом рельефные углубления на поверхности имплантата. Присутствие CaР покрытия способствует более ранней остеоинтеграции имплантатов и формированию прямой связи с костной тканью по сравнению с имплантатами без дополнительного покрытия титановой поверхности. Основная загвоздка состоит в том, чтобы воссоздать такой слой CaР покрытия, который бы растворялся со скоростью аналогичной депозиции костной ткани, ведь только таким образом удастся добиться прямого контакта кости с поверхностью имплантата.
В данной статье рассмотрено наиболее распространенные методы обработки поверхности имплантатов, а также различные оссобености их взаимодействия с биологическими жидкостями, клетками и костной тканью. В ходе дисскусии также проанализированы современные наномодификации поверхностей имплантатов, в том числе и путем СаР покрытия.
Наномодификации поверхности имплантатов
Модификации поверхности имплантатов помогают достичь улучшенного контакта кости с имплантатом, а также позитивно влияют на результаты их клинического использования. Для создания наноструктурных параметров титановой поверхности используется многочисленное количество методик, среди которых наиболее популярными являются следующие:
- Самоагрегированные монопокрытия (одиночные слои) (СМ).
- Химические модификации:
- Анодное оксидирование;
- Кислотное оксидирование или пероксидация;
- Использование щелочных соединений (NaOH).
- Физические модификации:
- Уплотнение наночастиц;
- Ионно-лучевая депозиция;
- Плазменное напыление;
- Пескоструйная обработка.
- Осаждения наночастиц:
- Золь-гелевые модификации (адсорбция коллоидных частиц);
- Депозиция дискретных кристаллов (ДДК);
- Литография и контактный способ принтинга.
- Сочетание физических и химических модификаций.
1. Метод молекулярной самоорганизации или использование самоагрегированных монопокрытий (одиночных слоев) (СМ)
Самоагрегируемые монослои создаются путем спонтанной хемосорбции и вертикального плотноупакованного позиционирования молекул на какой-то конкретный субстрат, при этом соединения, находящиеся в конце химической цепи остаются открытыми для взаимодействия. Germanier и коллеги в своих гистоморфометрических исследованиях на миниатюрных свиньях промемонстрировали роль подобных функциональных концевых групп на примере адгезии доменов пептидных молекул к монослою покрытия, состоящего из полиэтиленгликоля (ПЭГ) на титановой поверхности имплантата.
2. Метод анодного оксидирования
Анодное оксидирование или анодирование является одним из наиболее часто используемых методов получения наноструктурных окисей на поверхности титановых имплантатов, при котором удается получить частицы оксида металла с диаметром менее чем 100 нм. Титан в таком случае выступает в качестве анода, а инертная платиновая пластинка служит катодом. Оба элемента связаны с помощью медных проводов и соединены с положительным и отрицательным источником питания (30 V / 3 A) соответственно. В ходе анодирования анод и катод погружаются в раствор фторида водорода (концентрацией 0,5 мас% или 1,5 мас%), находящийся в тефлоновом химическом сосуде. Сильная кислота растворяет слой оксида, создавая при этом конфигурацию поверхности, необходимую для прохождения последовательных линий гальванического тока. Контролируя напряжения и плотность покрытия, можно регулировать диаметр наноструктур и расстояние между ними. Данный метод является относительно простым и экономичным способом модификации поверхности имплантата. Анодное оксидирование может быть использовано также в качестве метода для введения некоторых лекарств непосредственно в организм человека.
Регулируя время напряжения, можно модифицировать свойства нанопокрытия, при этом можно достичь диаметра нанотубул в диапазоне от 20 до 150 нм только благодаря изменениям параметром напряжения. В ходе исследований было обнаружено, что TiO2-модифицированное нанопокрытие, было более однородно при обработке электро-полированного титана, чем при использовании титана, полированного машинным методом. Щелочная фосфатаза (Alkaline phosphatase - ALP) является маркером остеогенного дифференцирования, поэтому было доказано, что TiO2-наночастицы с диаметром в 100 нм повышают уровень ALP активности сравнительно прогрессивнее, чем наночастицы с диаметром в 30-70 нм. Кроме того, повышение уровня активности АLP свидетельствует также о повышении остеоинтегративных характеристик костной ткани. Von Wilmowsky сделал вывод, что поверхность имплантата с модифицированным 30 нм TiO2-наночастицами интерфейсом положительно влияет как на формирование контакта кости с имплантатом, так и на образование костной ткани в периимплантатной области.
3. Кислотное оксидирование или пероксидация
Сочетание сильных кислот может быть эффективно использовано для создания нанопор диаметром 20-100 нм на поверхности титанового имплантата. Титан подвергают травлению с помощью раствора сильных кислот, например, H2SO4 / H2O2 или HCl / H2O2 или HF / H2O2 в условиях константной температуры и в течение определенного времени, после которого действие кислот приостанавливают путем добавления дистиллированной воды. После этого поверхность дополнительно промывают этанолом в ультразвуковой ванне на протяжении 20 минут, а затем высушивают. При обработке комбинацией кислот H2O2 / HCl удается достичь формирования новых наноструктур аморфного оксида титана на поверхности имплантата, а также увеличить адсорбцию RGD пептидов. При протравке сочетанием HF / H2O2 можно достичь формирования нанопор на поверхности титана, которая прежде поддавалась пескоструйной обработке. Некоторые исследования даже утверждают, что обработка отпескоструенной поверхности имплантата с помощью фтористоводородной кислоты обеспечивает более быстрое образование кости на его поверхности.
Isa с коллегами в ходе своих исследований подтвердили, что фторид-модифицированная титановая поверхность помогает оптимизировать положительную регуляцию cbfa-1 – фактора транскрипции, который имеет важное значение для созревания и дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток в остеобласты. Guo, проводя сравнение отпескоструенных TiO-поверхностей и TiO-поверхностей, подвергшихся как пескоструйной, так и кислотной обработке с помощью HF, сообщил, что только дополнительно обработанные кислотой поверхности демонстрируют признаки наномодификации и повышенный уровень остеогенной адгезии и реакции по сравнению с лишь механично обработанными поверхностями. Berglundh и коллеги в ходе эксперимента на шести беспородных собаках обнаружили, что имплантаты с фторид-модифицированными поверхностями способствуют процессу остеоинтеграции на ранних стадиях заживления после вмешательства. Регулируя такие параметры как температура, продолжительность действия и даже растворы кислотных веществ, можно изменять количество и глубину нанопор, дополнительно регулируя, таким образом, поведение остеогенных клеток. Обработка винтовых титановых имплантатов сочетанием H2SO4 H2O2 обеспечивает формирование такой наноконфигурации, которая в экспериментальных условиях in vivo инициировала акселерацию остеогенеза. В ходе исследования было также отмечено, что окислительная модификация способствует росту стволовых клеток, играющих роль депо для последующей дифференциации.
4. Метод обработки поверхностей имплантатов с использованием щелочей
Обработка титана посредством NaOH является довольно популярным методом среди исследователей, поскольку с его помощью можно не только воссоздать наномодифицированный рельеф, но и активировать некоторые реактивные группы веществ со стороны кости. Zhou и коллеги продемонстрировали, что применение NaOH катализирует образование Ti-наноструктур поверх поверхности имплантата. Раствор NaOH инициирует образование твердого геля титаната натрия на поверхности, который вызывает преципитацию и депозицию соединений гидроксиапатита. Подобная реакция наблюдалась и при действии щелочи на другие металлы, например, на цирконий и алюминий. Oh отметил ускоренный рост кристаллов гидроксиапатита на TiO2-поверхности имплантата, обработанной NaOH при имитации условий испытания на модели жидкостей тела (simulated body fluid -SBF).
5. Уплотнение наночастиц
Данный подход относится к физическим методам модификации поверхности имплантата, суть которого состоит в уплотнении наночастиц TiO2 из частиц микронного размера для получения наноизменненого слоя. Основное преимущество уплотнения наночастиц состоит в сохранении химической стабильности поверхности имплантата независимо от специфической топографии.
6. Конусно-лучевая депозиция
Coelho и Suzuki в ходе своих исследований пришли к выводу, что конусно-лучевое осаждение наночастиц (на примере гидроксиапатита) является альтернативным методом депозиции различных наносоставяющих на поверхности имплантата. Они доказали, что в ходе нанесения вещества путём ионного ассистирования можно добиться формирования тонкой пленки на поверхности имплантата, что может быть перспективно при покрытии эндооссального имплантата слоем биокерамики. Но экспериментальные исследования в данной области проводись пока что лишь на собаках.
7. Плазменное напыление
Плазменное напыление может обеспечить модификацию поверхностной наноструктуры титана частицами менее чем 100 нм в диаметре. В начале процесса используют вакуум для удаления какой-либо контаминации из поверхности титана, а затем обрабатывают ее направленным потоком кинетической энергии заряженных ионов металла или плазмы. С использованием данного подхода можно наносить различные материалы (Ag, Au, Ti и т.д.) на широкий спектр базовых субстратов (металлы, полимеры, керамика). Reising с коллегами обнаружил, что на напыленных поверхностях титана депонируется больше кальция, чем на обычном необработанном титане. Самым популярным методом напыления является плазменное диффузное нанесение гидроксиапатита на поверхность титатана, однако при данном подходе удается проконтролировать лишь состав покрытия и первоначальную толщину слоя. Повышение температуры, которое возникает при обработке, провоцирует частичное термическое разложение гидроксиапатита, в ходе которого образуются легкорастворимые формы аморфного СаР (22-62%), α-TCP, β-ТСР, тетра-CаP, а также оксида кальция. Это в свою очередь приводит к образованию неприемлемого и гетерогенного слоя, который в дальнейшем может стать причиной возникновения сразу нескольких проблем, среди которых ненадежная адгезия, продолжительное растворение покрытия, его частичная кристаллизация, неприемлемая биологическая стабильность модифицированной поверхности. Это может спровоцировать неудачу имплантата в области интерфейса поверхность-субстрат покрытия, а также значительно снизить уровни сопротивляемости, выносливости и прочности эндооссальной конструкции.
8. Пескоструйная обработка
С помощью данной методики пористый слой на поверхности имплантата достигается за счет ее столкновения с микроскопическими частицами. Толщина пористого слоя может быть изменена в зависимости от размера гранулированных частиц. Шероховатая поверхность, созданная таким образом, обладает свойством стимулировать экспрессию генов у остеобластов, а также повышает плотность соединения между костью и имплантатом.
Variola и коллеги продемонстрировали возможность создания 50-200 нм пористого слоя на поверхности титанового имплантата посредством пескоструйной обработки и протравки раствором фтористого водорода. Они обнаружили, что большинство имплантатов обработанных таким методом демонстрируют отличные показатели остеоинтеграции и стабильности сразу же в первый год после операционного вмешательства. Окись алюминия является одним из наиболее часто используемых веществ для подобной обработки титановой поверхности, однако Aparicio и коллеги обратили внимание на то, что частицы алюминия оксида могут отделяться от поверхности имплантата и абсорбироваться окружающими тканями, компрометируя, таким образом, процесс остеоинтеграции. Другими исследователями также был подтвержден некий негативный эффект пескоструйной обработки поверхности титана на процесс остеоинтеграции дентального имплантата.
Дробеструйная обработка с использованием керамических частиц бифазного фосфата кальция (Biphasic Calcium Phosphate – BCP) обеспечивает высокую степень шероховатости поверхности, а последующая кислотная обработка помогает очистить поверхность от всех излишков действующего вещества. В ходе анализа было доказано, что обработка посредством BCP стимулирует более раннее дифференцирование остеобластов и аппозицию костной ткани по сравнению с результатами обработки посредством оксида силиция или алюминия диоксида. Обработка поверхности имплантатов с помощью частиц TiO2 также показала интересные результаты в ходе проведения экспериментальных исследований. Ivanoff и коллеги обнаружили значительное улучшение контакта имплантат-кость по сравнению с контактом к необработанной поверхности титана. Аналогичный результат был подтвержден Rasmusson после выполнения экспериментального исследования на биологических моделях собачьих челюстей.
9. Метод золь-гелевой трансформации
Ben-Nissan и Choi в свое время тщательно изучили перспективы золь-гелевых трансформаций биологически активных нанопокрытий с целью их медицинского применения. Подобный подход помогает достичь депозиции нанометровых наслоений фосфата кальция на поверхности имплантата, что в разрезе атомно-масштабных взаимодействий характеризируется высоким уровнем физической адгезии. Использование техники золь-гелевой трансформации обеспечивает более точный контроль относительно структурных особенностей наслоения, а также возможность воссоздания гораздо более тонких покрытий, которые обеспечивают достаточно высокий уровень биологической стабильности. Методика обработки и характер покрытия могут регулироваться в процессе для того, чтобы регулировать силу соединения между поверхностью имплантата и слоем наносящегося субстрата.
10. Метод депозиции отдельных кристаллов (Discrete crystalline deposition - DCD)
Данный модифицированный подход был рассмотрен Nishimura и коллегами, которые предложили направленный подход к организации частиц CaPO4 на протравленную кислотой поверхность чистого титана. Депозиция дискретных наночастиц (20-40 нм) на обработанном кислотой титане обеспечивает повышенную механическую связь интраоссальной конструкции с окружающей костной тканью, а также более раннее формирование кости на поверхности имплантата, что было доказано на биологической модели с использованием крыс в ходе эксперимента. Основными факторами риска DCD являются возможность отслоения покрытия, а также потенциально токсичное влияние резидуального дебриса. В связи с этим Gutwein и Webster провели исследование с целью оценки взаимоотношений размера частиц, витальности клеток и процесса пролиферации в присутствии нанофазных частиц, сравнивая полученные при этом результаты с данными, полученными при использовании обычных микрочастиц оксида алюминия и диоксида титана. Они обнаружили, что наночастицы диоксида титана и оксида алюминия обладали менее негативным влиянием на жизнеспособность и пролиферацию клеток. Mendes с коллегами, изучая эффект DCD частиц CaPO4 на формирование связи поверхности Ti с костной тканью, пришли к выводу, что квантовое взаимодействие электронов высокой плотности на атомном уровне может быть использовано для обеспечения высокопрочного соединения между субстратом титановой поверхности и модифицированным нанопокрытием.
11. Метод литографии и техника контактного принтинга
Оптический метод литографии используется для создания наноконфигурации поверхности титана, при этом параметры наномодификации зависят от длины волны, используемой в процессе обработки поверхности. Но данные трудоемкие методы требуют еще значительного развития и оптимизации для их использования в клинической практике.
Взаимодействие протеинов и поверхности имплантата
Balsundaram и коллеги в свое время доказали, что нарушение инициальных процессов взаимодействия протеинов и поверхности имплантата является критическим для регуляции адгезии остеобластов. Взаимодействие белков и поверхности имплантата – по сути, начальная фаза процесса остеинтеграции. После установки имплантата на его поверхности происходит адсорбция белка, который в дальнейшем влияет на последующие процессы адгезии и пролиферации клеток. Fath и коллеги подчеркнули, что клеточная адгезия к белкам ЕСМ обеспечивается посредством интегриновых рецепторов, которые передают сигналы через систему фокальных контактов.
Tosatti и коллеги доказали, что RGD-содержащий пептид GCRGYGRGDSPG тормозит процесс дифференцировки остеобластов на поли-(L-лизин)-графт-полиэтиленгликоль–модифицированной поверхности титановых имплантатов. Они обнаружили, что интегрины связывают RGD фрагменты в клеточные протеины для последующей адгезии. Sinha и Tuan продемонстрировали роль фибронектина и витронектина в процессе клеточной адгезии остеобластов и других клеток к синтетическим поверхностям имплантатов. Нанотопографические модификации поверхностей имплантатов могут влиять на распределение клеток в процессе остеоинтеграции, а также на динамику фокальной адгезии клеток.
Изменение поверхностной энергии биоматериала является классическим и довольно хорошо изученным подходом для модификации взаимодействий между клетками организма и поверхностью конструкции. Изменение поверхностной энергии может значительно повлиять на адсорбцию ECM протеинов, что было доказано при использовании самоагрегированных монопокрытий, когда гидрофобные группы быстрее адсорбировали альбумин, чем ECM протеины. Впоследствии этого блокируется процесс клеточной адгезии. Гидрофобные поверхности лучше адсорбируют альбумин, чем ECM белки, поэтому наномодификации поверхности имплантатов являются столь важными для регуляции поверхностных взаимодействий. Увеличение адсорбции витронектина в области наноструктурных поверхностей доказано рядом исследований, сравнивающих аналогичные показатели для обычной поверхности имплантата. Webster и коллеги также обнаружили увеличение адгезии остеобластов на поверхности нанофазных частиц керамики по сравнению с другими типами клеток, например, фибробластами.
Scotchford исследовал феномен более высокой адсорбции фибронектина на гидрофильной поверхности золотого самоагрегированного покрытия, что также сопровождалось повышением формирования фокальной адгезии. В результате исследования оказалось очевидным, что клетки, напоминающие человеческие остеобласты, довольно хорошо соединяются с гидрофобными SAM-модифицированными поверхностями. Lim, изучавший адсорбцию белка, клеточную адгезию и формирование связи, доказал, что данные факторы зависят от повышения активности фокально-адгезивной киназы, а Cavalcanti-Adam, также проводивший подобные исследования, пришел к выводу, что миграция клеток как и динамика их фокальной адгезии, регулируются распространением интегриновых лиганд. Последний также обнаружил, что клетки, культивируемые на 58 нм модифицированной поверхности, формируют нормальную область фокальной адгезии, в то время как аналогичное культивирование на 108 нм-модифицированный поверхности не обеспечивает сопоставимых эффективных результатов. Park и Webster также изучали необходимость создания микрошероховатостей на поверхности имплантата как фактора, обеспечивающего оптимальное поверхностно-протеиновое взаимодействие.
Динамика поведения клеточных элементов
Наноструктурная топография влияет на поведение клеток в разрезе их адгезии, распространения и подвижности. Brunette в своих исследованиях показал, что динамика и изменение вышеупомянутых параметров может иметь как прямой, так и обратный характер взаимосвязи. Andersson и коллеги, изучая влияние титановых наномодификаций на морфологию эпителиальных клеток и продукцию цитокинов, сравнивали поведение клеток на Ti поверхности шириной 15 мм и глубиной канавок 185 нм с аналогичным показателем на титановом субстрате с глубиной модификаций в 100 нм, а также с полусферичными нановкраплениями диаметром 168 нм. Поведение клеток, как и продукция цитокинов, на первом субстрате с канавками оказалось приблизительно аналогичным таковому на плоской немодифицированной поверхности имплантата. На субстрате с полусферическими вкраплениями клетки имели меньшую площадь с большей мембранной проекцией. Морфологические изменения коррелировали со снижением секреции белка, поэтому было установлено, что модификации поверхности в диапазоне 70-100 нм позитивно влияют на уровень фокальной адгезии белков.
Wan и коллеги, в свою очередь, доказали, что адгезия клеток-предшественников костной ткани также увеличивается на поли-L-лактид (PLLA) и полистирол (PS)-наномодифицированных поверхностях имплантатов по сравнению с необработанными субстратами. ОСТ-1 остеобластоподобные клетки при этом росли вдоль поверхностей с двумя различными наноразмерами модификаций поверхностей (PLLA), а также в микронных порах полистиролового покрытия. Webster and Ejiofor продемонстрировали аналогичный эффект, сравнивая результат обработки поверхностей нано - и микрочастицами, что соответственно повлияло на адгезию остеобластов и пролиферацию клеток. Teixeira с сотрудниками, изучая природу эпителиального контакта на хорошо известных микро- и наноструктурированных поверхностях, продемонстрировали, что, когда клетки взаимодействуют с наноразмерной структурой, связь интегрина ограничивается границей адсорбированного белка на вершине гребня наномодификации. Топографические особенности, которые размером меньше, чем архитектура фокальной адгезии, ограничивают прикрепление клеток только к верхней части топографической модификации. Но подробности глубинных взаимосвязей с наномодифицированной поверхностью имплантата и клеточной адгезии продолжают исследоваться, ведь современное понимание влияния нанотопографии на связь с остеобластами нуждается в более глубоком изучении.
Dalby с сотрудниками изучал ответ клеток-предшественников костной ткани на определенные виды наномодифицированных топологий в форме углублений. Ученые доказали, что высокая плотность углублений уменьшает распространение клеток, поэтому упорядоченное формирование нанопор является более эффективным в данном отношении. Случайно созданные наномодификации провоцируют миграцию, а из этого следует, что наноструктурированные поверхности обеспечивают возможность модуляции поведения клеток с точки зрения клеточной адгезии и распространения. Lim и коллеги изучали реакцию остеобластов плода на полимерные нанотопографические интерфейсы. Они обнаружили, что клеточная адгезия зависит от особенностей нанотопографии (на PLLA субстрате с 3-45 нм-модификациями), а также взаимосвязана с поверхностными характеристиками рельефа самого субстрата и химической основой поверхности. Тем не менее, Cai не нашел существенных различий в показателях адсорбции фибронектина или пролиферации клеток на 2 нм- и 20 нм модифицированных поверхностях титана. Однако, эти данные могут быть аргументированы тем, что существует некая специфичность реакций клеток на особенности наномодификаций поверхности субстрата.
Исследователи сообщают, что активность фибробластов и мезенхимальных клеток сильно зависит от специфичного диапазона наноизменений поверхности имплантата. Hansen изучал влияние поверхностей с наномодифицированной топографией (11-38 нм) на модули упругости отдельных клеток остеобластов (MC3T3-E) с помощью атомно-силовой микроскопии (atomic force microscopy – АСМ).
Ему удалось измерить более высокие значения модуля упругости клеток на наномодифицированных поверхностях, чем на обычных контрольных субстратах. Также было обнаружено, что наноизменения поверхности фактически влияют на механические свойства отдельных клеток, что может быть вызвано интегрин обусловленным ремоделированием цитоскелета или более сложными биофизическими изменениями в структуре клеточной мембраны. Будущие исследования характера распространения клеток, как и клеточной подвижности, могут сыграть важную роль для биоинженерии оптимального интерфейса «имплантат-кость-слизистая».
Мезенхимальные стволовые клетки и поверхность дентальных имплантатов
Мезенхимальные стволовые клетки (МСК), как правило, являются клетками, которые способны к самообновлению и дифференциации в клетки различных специализированных тканей, таких как жир, кость и хрящ, нейроны. Первоначально эти клетки походят из соматических тканей, которые позже проходят процесс дифференциации в мезенхимальные и могут дифференцироваться дальше. Идентификация данных клеточных элементов возможна с помощью верификации экспрессии маркеров, по типу CD13, CD29,
CD44, CD54, CD73, CD90, CD105, CD166 с параллельной негативной реакцией на CD14, CD34 и CD45. Первоначально МСК были определены в костном мозге, но позже их удалось извлечь из жировой ткани, тканей серца, зубной пульпы, периферической крови. В условиях in vitro можна добиться дифференциации данного ряда клеточных элементов в адипоциты, хондроциты, остеобласты, нейроны, миоциты, гепатоциты, регулируя характер дифференциации специфическими индукционными агентами.
Основными функциями МСК являются развитие тканей, поддержка гомеостаза и репарация поврежденных областей, поэтому в регенеративной медицине они представляют собой инновационный инструмент, а с точки зрения стоматологии могут быть широко использованы для восстановления костной ткани челюстей или зубных структур.
Интеграция имплантата с окружающей костной тканью, как и взаимодействие с тканями десен, зависит от характера поведения тканей имплантационного ложа и поверхности интраоссальной конструкции. Реальной проблемой является управление колонизацией клеток и их дифференциацией на поверхности титанового субстрата. Регенерация тканей является хорошо организованным и последовательным процессом, который предусматривает миграцию, адгезию, пролиферацию и дифференциацию клеток. Исследователи доказали, что во время воспаления некоторые факторы, присутствующие и секретирующиеся в поврежденных тканях, способны инициировать миграцию в поврежденную область. В ходе исследований было показано, что миграцию и пролиферацию МСК могут стимулировать многие факторы, в том числе и факторы роста, среди которых PDGF, EGF, VEGF, TGF-β, ВМР-2 и ВМР-4.
Эти факторы роста секретируются в области поврежденных тканей клетками, отвечающими за процесс заживления. Кроме того, сгусток плазмы служит некой базисной сеткой для молекул фибрина и других биологически активных факторов, которые инициируют привлечение и дифференциацию МСК клеток в специфические функционально активные клетки.
Rock и коллеги в свою очередь продемонстрировали роль тромбоцитов при получении криопреципитатов для использования в качестве фибринового клея. Таким образом, они аргументировали роль факторов тромбоцитов для стимуляции пролиферации МСК. Сгусток плазмы при контакте с поверхностью имплантата представляет собой трехмерную микропористую структуру, которая является проницаемой для диффузии факторов, регулирующих дальнейшие изменения. Мигрировавшие в поврежденный участок мезенхимальные стволовые клетки крепятся как к поверхности локального экстрацелулярного матрикса, так и к поверхности имплантата, инициируя при этом обширную пролиферацию и регенерацию тканей, а модификация поверхности имплантатов в нанометровом диапазоне помогает только усилить биологические ответы на клеточном уровне.
Под действием некоторых специфических факторов, МС-клетки в области контакта с окружающей костной тканью дифференцируется в остеобласты, а в области контакта с десной – в фибробласты. В некоторых случаях поверхность имплантатов полностью инкапсулируется волокнистой тканью за счет пролиферации и дифференцировки МСК только в фибробласты. Эта волокнистая ткань предупреждает формирование непосредственного биологического соединения между имплантатом и примыкающей костью, что впоследствии приводит к неуспешности имплантации. Адгезия фибробластов к наноструктурированной поверхности имплантата ниже, нежели к немодифицированному титановому субстрату, поэтому логично, что Cohen в ходе своих исследований доказал сниженную активность фибробластов и увеличение функциональности остеобластов на поверхности титана после ионно-плазменной обработки. Кроме того, Miller сравнивал адгезию фибробластов и васкулярных клеток к наноструктурированным поверхностям из полимолочной и полигликолевой кислот, и подтвердил сниженную адгезию фибробластов к наномодифицированной субструктуре. Различные способы обработки поверхности титана, по примеру механической модификации, дробеструйного воздействия, плазменного напыления, химического травления и анодирования, могут эффективно использоваться для наноизменения конфигурации поверхностных свойств интраоссальной конструкции. Исследования доказали, что наношероховатости и нанопоры могут повысить адгезию остеобластов и дифференциацию клеток по сравнению наногладкими поверхностями. Также поверхности имплантатов с элементами микро - и нанопор продемонстрировали значительное повышение уровней роста и активности клеточных элементов, продукции матрикса и экспрессии генов человеских остеобластов, что в конечном счете, определяет позитивный исход процесса остеоинтеграции. Модуляции свойств поверхности помогают регулировать этапы адгезии, пролиферации и дифференциация МС-клеток, создавая благоприятные условия для интеграции тканей.
Бранемарк и коллеги в 1983 году описали остеоинтеграцию как прямой структурный и функциональный контакт кости с имплантатом, формирующийся под действием функциональных нагрузок. Процесс остеоинтеграции на границе костной ткани и имплантата зависит от химических характеристик, топографии и смачиваемости поверхности имплантата. В целях улучшения остеоинтеграции было проведено значительное количество исследований на животных относительно модификации поверхности титана в нанометровом диапазоне. Kubo, например, наблюдал существенное увеличение силы соединения имплантата и кости в 3,1 раза при наличии титановых нанотрубок (диаметром 300 нм) уже через 2 недели после имплантации в область бедренной кости крыс. Ogawa продемонстрировал увеличение площади контакта и прочности остеоинтеграции до 40% при наноструктуризации титана, сравнивая результаты при этом с обычной кислотно протравленной поверхностью титана при испытании на крысах. На основе этих исследований некоторые ученые смогли сопоставить процессы формирования костной ткани и долгосрочные реакции тканей на модификацию материалов у человека.
Покрытия на основе CAP и гидроксиапатита значительно улучшают процесс остеоинтеграции: в процессе заживления ионы кальция и фосфора высвобождаются в периимплантатные ткани, насыщая при этом локализованные биологические жидкости, которые впоследствии инициируют осаждение гидроксиапатита на поверхности имплантата в качестве подложки для дальнейшего формирования костной ткани. Многие исследователи продемонстрировали значимость кальций-фосфорного покрытия титановой поверхности имплантатов для улучшения остеоинтеграции. Le Guehennec и коллеги проводили гистоморфометрический анализ остеоинтеграции на четырех различных поверхностях имплантатов на эпифизе бедренной кости кролика через 2 и 8 недель после заживления. Они доказали, что метод биомиметического покрытия может значительно улучшить остеоинтеграцию с Ti-поверхностями имплантатов. Для этого нужно, чтобы кальций-фосфорное покрытие растворялось или деградировало под воздействием остеокластов со скоростью аналогичной костной аппозиции. CaР покрытия создаются с помощью биомиметических методов при физиологической температуре и рН, имитирующем аналогичный показатель жидкостей человека. Liu доказал возможность активации факторов роста при осаждении клеток на поверхности имплантатов с СаР покрытием. Кроме того, было аргументировано, что фактор BMP-2, который высвобождается с биомиметической поверхности покрытия имплантатов, индуцирует и поддерживает прямую оссификацию в условиях биологической модели крыс.
Выводы
Наномодификации поверхности имплантатов влияют на особенности их химической структуры и топографическую конфигурацию. Многие исследования уже доказали, что наноизменения титановой поверхности имеет огромное влияние на адсорбцию протеинов, формирование кровяного сгустка и поведение клеток, то есть на процессы, которые происходят после установки дентальных имплантатов. Соответственно, вышеупомянутые процессы влияют на миграцию, адгезию, пролиферацию и дифференциацию мезенхимальных стволовых клеток. Наномодификации поверхности могут помочь в регуляции дифференциации полипотентных клеток в специфические клеточные элементы аналогичные клеточным составляющим периимплантатных тканей. Таким образом, наноизменения титановой поверхности имплантатов могут значительно улучшить осстеоинтеграцию, а дальнейшие исследования в данной области только способствуют достижению успешных долгосрочных клинических результатов.
Авторы: Suryakant C. Deogade, MDS (Professor), Gunjan Dube, MDS (Reader), Sumathi K, MDS (Sr. Lecturer), Prashant Dube, MDS (Sr. Lecturer), Utkarsh Katare, MDS (Reader) , Divya Katare, MDS (Sr. Lecturer), Shreyansh Damade, MDS (Sr. Lecturer)
Дентальная имплантация является одним из вариантов замещения дефектов зубного ряда и в последние годы благодаря своим преимуществам стает все более распространенным стоматологическим вмешательством. Важными аспектами после хирургического вмешательства является достижение и поддержка остеоинтеграции, а также формирование связи между эпителием десен и поверхностью имплантата. Сама идея остеоинтеграции впервые появились в 1970-1980 гг. Сама по себе остеоинтеграция представляет собой структурно-функциональное слияние поверхности имплантата с окружающей костной тканью. Тесный контакт тканей десны с шейкой инфраконструкции помогает предотвратить риск бактериальной колонизации, которая провоцирует периимплантит. Непосредственная связь мягких тканей с поверхностью титана, напротив, создает условия для костного биомеханического укрепления интраоссального юнита. Первичная стабильность является первым и одним из важнейших аспектов для достижения остеоинтеграции и определяется качеством механической фиксации, дизайном самой конструкции и структурой костной ткани. На микроскопическом уровне дизайн винта, форма и шаг резьбы являются основополагающими факторами, влияющими на стабильность дентальных имплантатов. Abuhussen и коллеги пришли к выводу, что дизайн имплантата должен максимизировать распределение напряжений и в то же время минимизировать действие неблагоприятных стрессовых сил вдоль границы контакта кости с имплантатом. Меньший шаг резьбы, углубление витков и больший размер самой конструкции помогают увеличить площадь контакта поверхности имплантата с окружающей костной тканью.
Несколько исследований пытались оценить взаимодействия имплантата и кости при различных модификациях поверхности интраоссального винта. Так, например Variola и коллеги отметили значение микроизменений поверхности имплантата как фактора влияющего на миграцию и дифференциацию клеток-предшественников, что, в свою очередь, определяет процесс ремоделирования окружающей костной ткани. Некоторые исследователи доказали, что шероховатость поверхности способствует остеоинтеграции путем улучшения миграции клеток и повышения уровня их адгезии. Однако другие исследования докали еще и не менее важную роль микроскопических особенностей поверхности имплантата, определяющих особенности формирования костной ткани в месте контакта с имплантатом. Поэтому данный фактор является тоже косвенно влияющим на процесс остеоинтеграции. Однако, объективный контроль влияния поверхностных модификаций на изменения уровней протеинов и клеточных дифференциаций (то есть в нанометровом диапазоне) является довольно сложной задачей как для исследователей, так и для самих производителей дентальных имплантатов.
Нанотехнологии, по своему определению, направлены на «создание функциональных материалов, устройств и систем путем работы с веществом в нанометровом диапазоне (1-100 нм) с использованием новых свойств материалов (физических, химических, биологических), характерных для данных параметров вещества» (согласно дефиниции Национального управления аэронавтики и исследования космического пространства). Сам же термин «нанотехнологии» впервые предложил Норио Танигучи из Научного Университета Токио в 1974 г., который определил его следующим образом: «Нанотехнологии в основном базируются на обработке, разделении, консолидации и деформации вещества на уровне одного атома или одной молекулы, что предусматривает работу с частицами материалов в диапазоне от 1 до 100 (10-9) нм. Исходя из этого, материалы по их форме и структуре можно классифицировать как наноструктуры, нанокристаллы, нанопокрытия, наночастицы и нановолокна».
С помощью нанотехнологий можно создать поверхность имплантата с контролируемыми специфическими особенностями топографии и химического состава, которые помогут понять характер биологических взаимодействий субстратов, и, таким образом, способствуют разработке новых модификаций с предсказуемыми интеграционными характеристиками. Применение нанотехнологий при разработке биомедицинских поверхностей аргументировано способностью клеток к взаимодействию с нанометрическим рельефом посредством интегринов, которые, в свою очередь, обеспечивают связь с аргинин-глицин-аспартатной последовательностью пептидов. Клеточная адгезия к экстрацелюлярному матриксу (ЭЦМ) инициирует кластеризацию интегринов и образование фокальных интегриновых адгезивных комплексов (ФИАК), которые активируют целый каскад внутриклеточных сигнальных реакций. Нанотехнологии также решающим образом могут влиять на поведение и дифференциацию стволовых клеток. Остеобласты способны повторять трехмерные характеристики поверхности (линии, поры или точки) и при этом модулировать прирост кости в соответствии со структурными особенностями поверхности, на которую они мигрировали. Таким образом, структура поверхности играет одну из ключевых ролей в ходе приживания имплантата.
В последнее время также было разработано несколько новых технологий покрытия с нанесением гидроксиапатита и фосфатов кальция (CаP) на поверхность имплантатов. Было доказано, что СаР покрытие обеспечивает остеокондуктивные свойства поверхности имплантата, так как после имплантации кальций-фосфорные соединения подвергаются растворению в периимплантатной области, что, в свою очередь, увеличивает силу ионных взаимодействий и уровень насыщенности крови в области вмешательства. Данный процесс приводит к осаждению биологических нанокристаллов апатита на поверхности имплантата, что также предусматривает преципитацию протеинов и клеток-предшественников, которые благодаря своему содействию обеспечивают формирование экстрацелюлярного матрикса костной ткани. В ходе исследований также было продемонстрировано, что остеокласты способны разрушать структуру кальций-фосфорного покрытия поверхности посредством ферментов, создавая при этом рельефные углубления на поверхности имплантата. Присутствие CaР покрытия способствует более ранней остеоинтеграции имплантатов и формированию прямой связи с костной тканью по сравнению с имплантатами без дополнительного покрытия титановой поверхности. Основная загвоздка состоит в том, чтобы воссоздать такой слой CaР покрытия, который бы растворялся со скоростью аналогичной депозиции костной ткани, ведь только таким образом удастся добиться прямого контакта кости с поверхностью имплантата.
В данной статье рассмотрено наиболее распространенные методы обработки поверхности имплантатов, а также различные оссобености их взаимодействия с биологическими жидкостями, клетками и костной тканью. В ходе дисскусии также проанализированы современные наномодификации поверхностей имплантатов, в том числе и путем СаР покрытия.
Наномодификации поверхности имплантатов
Модификации поверхности имплантатов помогают достичь улучшенного контакта кости с имплантатом, а также позитивно влияют на результаты их клинического использования. Для создания наноструктурных параметров титановой поверхности используется многочисленное количество методик, среди которых наиболее популярными являются следующие:
- Самоагрегированные монопокрытия (одиночные слои) (СМ).
- Химические модификации:
- Анодное оксидирование;
- Кислотное оксидирование или пероксидация;
- Использование щелочных соединений (NaOH).
- Физические модификации:
- Уплотнение наночастиц;
- Ионно-лучевая депозиция;
- Плазменное напыление;
- Пескоструйная обработка.
- Осаждения наночастиц:
- Золь-гелевые модификации (адсорбция коллоидных частиц);
- Депозиция дискретных кристаллов (ДДК);
- Литография и контактный способ принтинга.
- Сочетание физических и химических модификаций.
1. Метод молекулярной самоорганизации или использование самоагрегированных монопокрытий (одиночных слоев) (СМ)
Самоагрегируемые монослои создаются путем спонтанной хемосорбции и вертикального плотноупакованного позиционирования молекул на какой-то конкретный субстрат, при этом соединения, находящиеся в конце химической цепи остаются открытыми для взаимодействия. Germanier и коллеги в своих гистоморфометрических исследованиях на миниатюрных свиньях промемонстрировали роль подобных функциональных концевых групп на примере адгезии доменов пептидных молекул к монослою покрытия, состоящего из полиэтиленгликоля (ПЭГ) на титановой поверхности имплантата.
2. Метод анодного оксидирования
Анодное оксидирование или анодирование является одним из наиболее часто используемых методов получения наноструктурных окисей на поверхности титановых имплантатов, при котором удается получить частицы оксида металла с диаметром менее чем 100 нм. Титан в таком случае выступает в качестве анода, а инертная платиновая пластинка служит катодом. Оба элемента связаны с помощью медных проводов и соединены с положительным и отрицательным источником питания (30 V / 3 A) соответственно. В ходе анодирования анод и катод погружаются в раствор фторида водорода (концентрацией 0,5 мас% или 1,5 мас%), находящийся в тефлоновом химическом сосуде. Сильная кислота растворяет слой оксида, создавая при этом конфигурацию поверхности, необходимую для прохождения последовательных линий гальванического тока. Контролируя напряжения и плотность покрытия, можно регулировать диаметр наноструктур и расстояние между ними. Данный метод является относительно простым и экономичным способом модификации поверхности имплантата. Анодное оксидирование может быть использовано также в качестве метода для введения некоторых лекарств непосредственно в организм человека.
Регулируя время напряжения, можно модифицировать свойства нанопокрытия, при этом можно достичь диаметра нанотубул в диапазоне от 20 до 150 нм только благодаря изменениям параметром напряжения. В ходе исследований было обнаружено, что TiO2-модифицированное нанопокрытие, было более однородно при обработке электро-полированного титана, чем при использовании титана, полированного машинным методом. Щелочная фосфатаза (Alkaline phosphatase - ALP) является маркером остеогенного дифференцирования, поэтому было доказано, что TiO2-наночастицы с диаметром в 100 нм повышают уровень ALP активности сравнительно прогрессивнее, чем наночастицы с диаметром в 30-70 нм. Кроме того, повышение уровня активности АLP свидетельствует также о повышении остеоинтегративных характеристик костной ткани. Von Wilmowsky сделал вывод, что поверхность имплантата с модифицированным 30 нм TiO2-наночастицами интерфейсом положительно влияет как на формирование контакта кости с имплантатом, так и на образование костной ткани в периимплантатной области.
3. Кислотное оксидирование или пероксидация
Сочетание сильных кислот может быть эффективно использовано для создания нанопор диаметром 20-100 нм на поверхности титанового имплантата. Титан подвергают травлению с помощью раствора сильных кислот, например, H2SO4 / H2O2 или HCl / H2O2 или HF / H2O2 в условиях константной температуры и в течение определенного времени, после которого действие кислот приостанавливают путем добавления дистиллированной воды. После этого поверхность дополнительно промывают этанолом в ультразвуковой ванне на протяжении 20 минут, а затем высушивают. При обработке комбинацией кислот H2O2 / HCl удается достичь формирования новых наноструктур аморфного оксида титана на поверхности имплантата, а также увеличить адсорбцию RGD пептидов. При протравке сочетанием HF / H2O2 можно достичь формирования нанопор на поверхности титана, которая прежде поддавалась пескоструйной обработке. Некоторые исследования даже утверждают, что обработка отпескоструенной поверхности имплантата с помощью фтористоводородной кислоты обеспечивает более быстрое образование кости на его поверхности.
Isa с коллегами в ходе своих исследований подтвердили, что фторид-модифицированная титановая поверхность помогает оптимизировать положительную регуляцию cbfa-1 – фактора транскрипции, который имеет важное значение для созревания и дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток в остеобласты. Guo, проводя сравнение отпескоструенных TiO-поверхностей и TiO-поверхностей, подвергшихся как пескоструйной, так и кислотной обработке с помощью HF, сообщил, что только дополнительно обработанные кислотой поверхности демонстрируют признаки наномодификации и повышенный уровень остеогенной адгезии и реакции по сравнению с лишь механично обработанными поверхностями. Berglundh и коллеги в ходе эксперимента на шести беспородных собаках обнаружили, что имплантаты с фторид-модифицированными поверхностями способствуют процессу остеоинтеграции на ранних стадиях заживления после вмешательства. Регулируя такие параметры как температура, продолжительность действия и даже растворы кислотных веществ, можно изменять количество и глубину нанопор, дополнительно регулируя, таким образом, поведение остеогенных клеток. Обработка винтовых титановых имплантатов сочетанием H2SO4 H2O2 обеспечивает формирование такой наноконфигурации, которая в экспериментальных условиях in vivo инициировала акселерацию остеогенеза. В ходе исследования было также отмечено, что окислительная модификация способствует росту стволовых клеток, играющих роль депо для последующей дифференциации.
4. Метод обработки поверхностей имплантатов с использованием щелочей
Обработка титана посредством NaOH является довольно популярным методом среди исследователей, поскольку с его помощью можно не только воссоздать наномодифицированный рельеф, но и активировать некоторые реактивные группы веществ со стороны кости. Zhou и коллеги продемонстрировали, что применение NaOH катализирует образование Ti-наноструктур поверх поверхности имплантата. Раствор NaOH инициирует образование твердого геля титаната натрия на поверхности, который вызывает преципитацию и депозицию соединений гидроксиапатита. Подобная реакция наблюдалась и при действии щелочи на другие металлы, например, на цирконий и алюминий. Oh отметил ускоренный рост кристаллов гидроксиапатита на TiO2-поверхности имплантата, обработанной NaOH при имитации условий испытания на модели жидкостей тела (simulated body fluid -SBF).
5. Уплотнение наночастиц
Данный подход относится к физическим методам модификации поверхности имплантата, суть которого состоит в уплотнении наночастиц TiO2 из частиц микронного размера для получения наноизменненого слоя. Основное преимущество уплотнения наночастиц состоит в сохранении химической стабильности поверхности имплантата независимо от специфической топографии.
6. Конусно-лучевая депозиция
Coelho и Suzuki в ходе своих исследований пришли к выводу, что конусно-лучевое осаждение наночастиц (на примере гидроксиапатита) является альтернативным методом депозиции различных наносоставяющих на поверхности имплантата. Они доказали, что в ходе нанесения вещества путём ионного ассистирования можно добиться формирования тонкой пленки на поверхности имплантата, что может быть перспективно при покрытии эндооссального имплантата слоем биокерамики. Но экспериментальные исследования в данной области проводись пока что лишь на собаках.
7. Плазменное напыление
Плазменное напыление может обеспечить модификацию поверхностной наноструктуры титана частицами менее чем 100 нм в диаметре. В начале процесса используют вакуум для удаления какой-либо контаминации из поверхности титана, а затем обрабатывают ее направленным потоком кинетической энергии заряженных ионов металла или плазмы. С использованием данного подхода можно наносить различные материалы (Ag, Au, Ti и т.д.) на широкий спектр базовых субстратов (металлы, полимеры, керамика). Reising с коллегами обнаружил, что на напыленных поверхностях титана депонируется больше кальция, чем на обычном необработанном титане. Самым популярным методом напыления является плазменное диффузное нанесение гидроксиапатита на поверхность титатана, однако при данном подходе удается проконтролировать лишь состав покрытия и первоначальную толщину слоя. Повышение температуры, которое возникает при обработке, провоцирует частичное термическое разложение гидроксиапатита, в ходе которого образуются легкорастворимые формы аморфного СаР (22-62%), α-TCP, β-ТСР, тетра-CаP, а также оксида кальция. Это в свою очередь приводит к образованию неприемлемого и гетерогенного слоя, который в дальнейшем может стать причиной возникновения сразу нескольких проблем, среди которых ненадежная адгезия, продолжительное растворение покрытия, его частичная кристаллизация, неприемлемая биологическая стабильность модифицированной поверхности. Это может спровоцировать неудачу имплантата в области интерфейса поверхность-субстрат покрытия, а также значительно снизить уровни сопротивляемости, выносливости и прочности эндооссальной конструкции.
8. Пескоструйная обработка
С помощью данной методики пористый слой на поверхности имплантата достигается за счет ее столкновения с микроскопическими частицами. Толщина пористого слоя может быть изменена в зависимости от размера гранулированных частиц. Шероховатая поверхность, созданная таким образом, обладает свойством стимулировать экспрессию генов у остеобластов, а также повышает плотность соединения между костью и имплантатом.
Variola и коллеги продемонстрировали возможность создания 50-200 нм пористого слоя на поверхности титанового имплантата посредством пескоструйной обработки и протравки раствором фтористого водорода. Они обнаружили, что большинство имплантатов обработанных таким методом демонстрируют отличные показатели остеоинтеграции и стабильности сразу же в первый год после операционного вмешательства. Окись алюминия является одним из наиболее часто используемых веществ для подобной обработки титановой поверхности, однако Aparicio и коллеги обратили внимание на то, что частицы алюминия оксида могут отделяться от поверхности имплантата и абсорбироваться окружающими тканями, компрометируя, таким образом, процесс остеоинтеграции. Другими исследователями также был подтвержден некий негативный эффект пескоструйной обработки поверхности титана на процесс остеоинтеграции дентального имплантата.
Дробеструйная обработка с использованием керамических частиц бифазного фосфата кальция (Biphasic Calcium Phosphate – BCP) обеспечивает высокую степень шероховатости поверхности, а последующая кислотная обработка помогает очистить поверхность от всех излишков действующего вещества. В ходе анализа было доказано, что обработка посредством BCP стимулирует более раннее дифференцирование остеобластов и аппозицию костной ткани по сравнению с результатами обработки посредством оксида силиция или алюминия диоксида. Обработка поверхности имплантатов с помощью частиц TiO2 также показала интересные результаты в ходе проведения экспериментальных исследований. Ivanoff и коллеги обнаружили значительное улучшение контакта имплантат-кость по сравнению с контактом к необработанной поверхности титана. Аналогичный результат был подтвержден Rasmusson после выполнения экспериментального исследования на биологических моделях собачьих челюстей.
9. Метод золь-гелевой трансформации
Ben-Nissan и Choi в свое время тщательно изучили перспективы золь-гелевых трансформаций биологически активных нанопокрытий с целью их медицинского применения. Подобный подход помогает достичь депозиции нанометровых наслоений фосфата кальция на поверхности имплантата, что в разрезе атомно-масштабных взаимодействий характеризируется высоким уровнем физической адгезии. Использование техники золь-гелевой трансформации обеспечивает более точный контроль относительно структурных особенностей наслоения, а также возможность воссоздания гораздо более тонких покрытий, которые обеспечивают достаточно высокий уровень биологической стабильности. Методика обработки и характер покрытия могут регулироваться в процессе для того, чтобы регулировать силу соединения между поверхностью имплантата и слоем наносящегося субстрата.
10. Метод депозиции отдельных кристаллов (Discrete crystalline deposition - DCD)
Данный модифицированный подход был рассмотрен Nishimura и коллегами, которые предложили направленный подход к организации частиц CaPO4 на протравленную кислотой поверхность чистого титана. Депозиция дискретных наночастиц (20-40 нм) на обработанном кислотой титане обеспечивает повышенную механическую связь интраоссальной конструкции с окружающей костной тканью, а также более раннее формирование кости на поверхности имплантата, что было доказано на биологической модели с использованием крыс в ходе эксперимента. Основными факторами риска DCD являются возможность отслоения покрытия, а также потенциально токсичное влияние резидуального дебриса. В связи с этим Gutwein и Webster провели исследование с целью оценки взаимоотношений размера частиц, витальности клеток и процесса пролиферации в присутствии нанофазных частиц, сравнивая полученные при этом результаты с данными, полученными при использовании обычных микрочастиц оксида алюминия и диоксида титана. Они обнаружили, что наночастицы диоксида титана и оксида алюминия обладали менее негативным влиянием на жизнеспособность и пролиферацию клеток. Mendes с коллегами, изучая эффект DCD частиц CaPO4 на формирование связи поверхности Ti с костной тканью, пришли к выводу, что квантовое взаимодействие электронов высокой плотности на атомном уровне может быть использовано для обеспечения высокопрочного соединения между субстратом титановой поверхности и модифицированным нанопокрытием.
11. Метод литографии и техника контактного принтинга
Оптический метод литографии используется для создания наноконфигурации поверхности титана, при этом параметры наномодификации зависят от длины волны, используемой в процессе обработки поверхности. Но данные трудоемкие методы требуют еще значительного развития и оптимизации для их использования в клинической практике.
Взаимодействие протеинов и поверхности имплантата
Balsundaram и коллеги в свое время доказали, что нарушение инициальных процессов взаимодействия протеинов и поверхности имплантата является критическим для регуляции адгезии остеобластов. Взаимодействие белков и поверхности имплантата – по сути, начальная фаза процесса остеинтеграции. После установки имплантата на его поверхности происходит адсорбция белка, который в дальнейшем влияет на последующие процессы адгезии и пролиферации клеток. Fath и коллеги подчеркнули, что клеточная адгезия к белкам ЕСМ обеспечивается посредством интегриновых рецепторов, которые передают сигналы через систему фокальных контактов.
Tosatti и коллеги доказали, что RGD-содержащий пептид GCRGYGRGDSPG тормозит процесс дифференцировки остеобластов на поли-(L-лизин)-графт-полиэтиленгликоль–модифицированной поверхности титановых имплантатов. Они обнаружили, что интегрины связывают RGD фрагменты в клеточные протеины для последующей адгезии. Sinha и Tuan продемонстрировали роль фибронектина и витронектина в процессе клеточной адгезии остеобластов и других клеток к синтетическим поверхностям имплантатов. Нанотопографические модификации поверхностей имплантатов могут влиять на распределение клеток в процессе остеоинтеграции, а также на динамику фокальной адгезии клеток.
Изменение поверхностной энергии биоматериала является классическим и довольно хорошо изученным подходом для модификации взаимодействий между клетками организма и поверхностью конструкции. Изменение поверхностной энергии может значительно повлиять на адсорбцию ECM протеинов, что было доказано при использовании самоагрегированных монопокрытий, когда гидрофобные группы быстрее адсорбировали альбумин, чем ECM протеины. Впоследствии этого блокируется процесс клеточной адгезии. Гидрофобные поверхности лучше адсорбируют альбумин, чем ECM белки, поэтому наномодификации поверхности имплантатов являются столь важными для регуляции поверхностных взаимодействий. Увеличение адсорбции витронектина в области наноструктурных поверхностей доказано рядом исследований, сравнивающих аналогичные показатели для обычной поверхности имплантата. Webster и коллеги также обнаружили увеличение адгезии остеобластов на поверхности нанофазных частиц керамики по сравнению с другими типами клеток, например, фибробластами.
Scotchford исследовал феномен более высокой адсорбции фибронектина на гидрофильной поверхности золотого самоагрегированного покрытия, что также сопровождалось повышением формирования фокальной адгезии. В результате исследования оказалось очевидным, что клетки, напоминающие человеческие остеобласты, довольно хорошо соединяются с гидрофобными SAM-модифицированными поверхностями. Lim, изучавший адсорбцию белка, клеточную адгезию и формирование связи, доказал, что данные факторы зависят от повышения активности фокально-адгезивной киназы, а Cavalcanti-Adam, также проводивший подобные исследования, пришел к выводу, что миграция клеток как и динамика их фокальной адгезии, регулируются распространением интегриновых лиганд. Последний также обнаружил, что клетки, культивируемые на 58 нм модифицированной поверхности, формируют нормальную область фокальной адгезии, в то время как аналогичное культивирование на 108 нм-модифицированный поверхности не обеспечивает сопоставимых эффективных результатов. Park и Webster также изучали необходимость создания микрошероховатостей на поверхности имплантата как фактора, обеспечивающего оптимальное поверхностно-протеиновое взаимодействие.
Динамика поведения клеточных элементов
Наноструктурная топография влияет на поведение клеток в разрезе их адгезии, распространения и подвижности. Brunette в своих исследованиях показал, что динамика и изменение вышеупомянутых параметров может иметь как прямой, так и обратный характер взаимосвязи. Andersson и коллеги, изучая влияние титановых наномодификаций на морфологию эпителиальных клеток и продукцию цитокинов, сравнивали поведение клеток на Ti поверхности шириной 15 мм и глубиной канавок 185 нм с аналогичным показателем на титановом субстрате с глубиной модификаций в 100 нм, а также с полусферичными нановкраплениями диаметром 168 нм. Поведение клеток, как и продукция цитокинов, на первом субстрате с канавками оказалось приблизительно аналогичным таковому на плоской немодифицированной поверхности имплантата. На субстрате с полусферическими вкраплениями клетки имели меньшую площадь с большей мембранной проекцией. Морфологические изменения коррелировали со снижением секреции белка, поэтому было установлено, что модификации поверхности в диапазоне 70-100 нм позитивно влияют на уровень фокальной адгезии белков.
Wan и коллеги, в свою очередь, доказали, что адгезия клеток-предшественников костной ткани также увеличивается на поли-L-лактид (PLLA) и полистирол (PS)-наномодифицированных поверхностях имплантатов по сравнению с необработанными субстратами. ОСТ-1 остеобластоподобные клетки при этом росли вдоль поверхностей с двумя различными наноразмерами модификаций поверхностей (PLLA), а также в микронных порах полистиролового покрытия. Webster and Ejiofor продемонстрировали аналогичный эффект, сравнивая результат обработки поверхностей нано - и микрочастицами, что соответственно повлияло на адгезию остеобластов и пролиферацию клеток. Teixeira с сотрудниками, изучая природу эпителиального контакта на хорошо известных микро- и наноструктурированных поверхностях, продемонстрировали, что, когда клетки взаимодействуют с наноразмерной структурой, связь интегрина ограничивается границей адсорбированного белка на вершине гребня наномодификации. Топографические особенности, которые размером меньше, чем архитектура фокальной адгезии, ограничивают прикрепление клеток только к верхней части топографической модификации. Но подробности глубинных взаимосвязей с наномодифицированной поверхностью имплантата и клеточной адгезии продолжают исследоваться, ведь современное понимание влияния нанотопографии на связь с остеобластами нуждается в более глубоком изучении.
Dalby с сотрудниками изучал ответ клеток-предшественников костной ткани на определенные виды наномодифицированных топологий в форме углублений. Ученые доказали, что высокая плотность углублений уменьшает распространение клеток, поэтому упорядоченное формирование нанопор является более эффективным в данном отношении. Случайно созданные наномодификации провоцируют миграцию, а из этого следует, что наноструктурированные поверхности обеспечивают возможность модуляции поведения клеток с точки зрения клеточной адгезии и распространения. Lim и коллеги изучали реакцию остеобластов плода на полимерные нанотопографические интерфейсы. Они обнаружили, что клеточная адгезия зависит от особенностей нанотопографии (на PLLA субстрате с 3-45 нм-модификациями), а также взаимосвязана с поверхностными характеристиками рельефа самого субстрата и химической основой поверхности. Тем не менее, Cai не нашел существенных различий в показателях адсорбции фибронектина или пролиферации клеток на 2 нм- и 20 нм модифицированных поверхностях титана. Однако, эти данные могут быть аргументированы тем, что существует некая специфичность реакций клеток на особенности наномодификаций поверхности субстрата.
Исследователи сообщают, что активность фибробластов и мезенхимальных клеток сильно зависит от специфичного диапазона наноизменений поверхности имплантата. Hansen изучал влияние поверхностей с наномодифицированной топографией (11-38 нм) на модули упругости отдельных клеток остеобластов (MC3T3-E) с помощью атомно-силовой микроскопии (atomic force microscopy – АСМ).
Ему удалось измерить более высокие значения модуля упругости клеток на наномодифицированных поверхностях, чем на обычных контрольных субстратах. Также было обнаружено, что наноизменения поверхности фактически влияют на механические свойства отдельных клеток, что может быть вызвано интегрин обусловленным ремоделированием цитоскелета или более сложными биофизическими изменениями в структуре клеточной мембраны. Будущие исследования характера распространения клеток, как и клеточной подвижности, могут сыграть важную роль для биоинженерии оптимального интерфейса «имплантат-кость-слизистая».
Мезенхимальные стволовые клетки и поверхность дентальных имплантатов
Мезенхимальные стволовые клетки (МСК), как правило, являются клетками, которые способны к самообновлению и дифференциации в клетки различных специализированных тканей, таких как жир, кость и хрящ, нейроны. Первоначально эти клетки походят из соматических тканей, которые позже проходят процесс дифференциации в мезенхимальные и могут дифференцироваться дальше. Идентификация данных клеточных элементов возможна с помощью верификации экспрессии маркеров, по типу CD13, CD29,
CD44, CD54, CD73, CD90, CD105, CD166 с параллельной негативной реакцией на CD14, CD34 и CD45. Первоначально МСК были определены в костном мозге, но позже их удалось извлечь из жировой ткани, тканей серца, зубной пульпы, периферической крови. В условиях in vitro можна добиться дифференциации данного ряда клеточных элементов в адипоциты, хондроциты, остеобласты, нейроны, миоциты, гепатоциты, регулируя характер дифференциации специфическими индукционными агентами.
Основными функциями МСК являются развитие тканей, поддержка гомеостаза и репарация поврежденных областей, поэтому в регенеративной медицине они представляют собой инновационный инструмент, а с точки зрения стоматологии могут быть широко использованы для восстановления костной ткани челюстей или зубных структур.
Интеграция имплантата с окружающей костной тканью, как и взаимодействие с тканями десен, зависит от характера поведения тканей имплантационного ложа и поверхности интраоссальной конструкции. Реальной проблемой является управление колонизацией клеток и их дифференциацией на поверхности титанового субстрата. Регенерация тканей является хорошо организованным и последовательным процессом, который предусматривает миграцию, адгезию, пролиферацию и дифференциацию клеток. Исследователи доказали, что во время воспаления некоторые факторы, присутствующие и секретирующиеся в поврежденных тканях, способны инициировать миграцию в поврежденную область. В ходе исследований было показано, что миграцию и пролиферацию МСК могут стимулировать многие факторы, в том числе и факторы роста, среди которых PDGF, EGF, VEGF, TGF-β, ВМР-2 и ВМР-4.
Эти факторы роста секретируются в области поврежденных тканей клетками, отвечающими за процесс заживления. Кроме того, сгусток плазмы служит некой базисной сеткой для молекул фибрина и других биологически активных факторов, которые инициируют привлечение и дифференциацию МСК клеток в специфические функционально активные клетки.
Rock и коллеги в свою очередь продемонстрировали роль тромбоцитов при получении криопреципитатов для использования в качестве фибринового клея. Таким образом, они аргументировали роль факторов тромбоцитов для стимуляции пролиферации МСК. Сгусток плазмы при контакте с поверхностью имплантата представляет собой трехмерную микропористую структуру, которая является проницаемой для диффузии факторов, регулирующих дальнейшие изменения. Мигрировавшие в поврежденный участок мезенхимальные стволовые клетки крепятся как к поверхности локального экстрацелулярного матрикса, так и к поверхности имплантата, инициируя при этом обширную пролиферацию и регенерацию тканей, а модификация поверхности имплантатов в нанометровом диапазоне помогает только усилить биологические ответы на клеточном уровне.
Под действием некоторых специфических факторов, МС-клетки в области контакта с окружающей костной тканью дифференцируется в остеобласты, а в области контакта с десной – в фибробласты. В некоторых случаях поверхность имплантатов полностью инкапсулируется волокнистой тканью за счет пролиферации и дифференцировки МСК только в фибробласты. Эта волокнистая ткань предупреждает формирование непосредственного биологического соединения между имплантатом и примыкающей костью, что впоследствии приводит к неуспешности имплантации. Адгезия фибробластов к наноструктурированной поверхности имплантата ниже, нежели к немодифицированному титановому субстрату, поэтому логично, что Cohen в ходе своих исследований доказал сниженную активность фибробластов и увеличение функциональности остеобластов на поверхности титана после ионно-плазменной обработки. Кроме того, Miller сравнивал адгезию фибробластов и васкулярных клеток к наноструктурированным поверхностям из полимолочной и полигликолевой кислот, и подтвердил сниженную адгезию фибробластов к наномодифицированной субструктуре. Различные способы обработки поверхности титана, по примеру механической модификации, дробеструйного воздействия, плазменного напыления, химического травления и анодирования, могут эффективно использоваться для наноизменения конфигурации поверхностных свойств интраоссальной конструкции. Исследования доказали, что наношероховатости и нанопоры могут повысить адгезию остеобластов и дифференциацию клеток по сравнению наногладкими поверхностями. Также поверхности имплантатов с элементами микро - и нанопор продемонстрировали значительное повышение уровней роста и активности клеточных элементов, продукции матрикса и экспрессии генов человеских остеобластов, что в конечном счете, определяет позитивный исход процесса остеоинтеграции. Модуляции свойств поверхности помогают регулировать этапы адгезии, пролиферации и дифференциация МС-клеток, создавая благоприятные условия для интеграции тканей.
Бранемарк и коллеги в 1983 году описали остеоинтеграцию как прямой структурный и функциональный контакт кости с имплантатом, формирующийся под действием функциональных нагрузок. Процесс остеоинтеграции на границе костной ткани и имплантата зависит от химических характеристик, топографии и смачиваемости поверхности имплантата. В целях улучшения остеоинтеграции было проведено значительное количество исследований на животных относительно модификации поверхности титана в нанометровом диапазоне. Kubo, например, наблюдал существенное увеличение силы соединения имплантата и кости в 3,1 раза при наличии титановых нанотрубок (диаметром 300 нм) уже через 2 недели после имплантации в область бедренной кости крыс. Ogawa продемонстрировал увеличение площади контакта и прочности остеоинтеграции до 40% при наноструктуризации титана, сравнивая результаты при этом с обычной кислотно протравленной поверхностью титана при испытании на крысах. На основе этих исследований некоторые ученые смогли сопоставить процессы формирования костной ткани и долгосрочные реакции тканей на модификацию материалов у человека.
Покрытия на основе CAP и гидроксиапатита значительно улучшают процесс остеоинтеграции: в процессе заживления ионы кальция и фосфора высвобождаются в периимплантатные ткани, насыщая при этом локализованные биологические жидкости, которые впоследствии инициируют осаждение гидроксиапатита на поверхности имплантата в качестве подложки для дальнейшего формирования костной ткани. Многие исследователи продемонстрировали значимость кальций-фосфорного покрытия титановой поверхности имплантатов для улучшения остеоинтеграции. Le Guehennec и коллеги проводили гистоморфометрический анализ остеоинтеграции на четырех различных поверхностях имплантатов на эпифизе бедренной кости кролика через 2 и 8 недель после заживления. Они доказали, что метод биомиметического покрытия может значительно улучшить остеоинтеграцию с Ti-поверхностями имплантатов. Для этого нужно, чтобы кальций-фосфорное покрытие растворялось или деградировало под воздействием остеокластов со скоростью аналогичной костной аппозиции. CaР покрытия создаются с помощью биомиметических методов при физиологической температуре и рН, имитирующем аналогичный показатель жидкостей человека. Liu доказал возможность активации факторов роста при осаждении клеток на поверхности имплантатов с СаР покрытием. Кроме того, было аргументировано, что фактор BMP-2, который высвобождается с биомиметической поверхности покрытия имплантатов, индуцирует и поддерживает прямую оссификацию в условиях биологической модели крыс.
Выводы
Наномодификации поверхности имплантатов влияют на особенности их химической структуры и топографическую конфигурацию. Многие исследования уже доказали, что наноизменения титановой поверхности имеет огромное влияние на адсорбцию протеинов, формирование кровяного сгустка и поведение клеток, то есть на процессы, которые происходят после установки дентальных имплантатов. Соответственно, вышеупомянутые процессы влияют на миграцию, адгезию, пролиферацию и дифференциацию мезенхимальных стволовых клеток. Наномодификации поверхности могут помочь в регуляции дифференциации полипотентных клеток в специфические клеточные элементы аналогичные клеточным составляющим периимплантатных тканей. Таким образом, наноизменения титановой поверхности имплантатов могут значительно улучшить осстеоинтеграцию, а дальнейшие исследования в данной области только способствуют достижению успешных долгосрочных клинических результатов.
Авторы: Suryakant C. Deogade, MDS (Professor), Gunjan Dube, MDS (Reader), Sumathi K, MDS (Sr. Lecturer), Prashant Dube, MDS (Sr. Lecturer), Utkarsh Katare, MDS (Reader) , Divya Katare, MDS (Sr. Lecturer), Shreyansh Damade, MDS (Sr. Lecturer)
Читайте также:
Статьи от брендов
0 комментариев