Новая концепция в гибридизации Bromelain Enzyme для депротеинизации дентина перед нанесением адгезивной системы

29 октября 2014, 11:00

Деминерализацию дентина посредством кондиционирования кислотами следует считать комплексным процессом, ограниченным поверхностными слоями тканей. Кислотное протравливание данной зоны не только удаляет смазанный слой, но также полностью деминерализирует несколько микрометров поверхностного слоя, обнажая коллагеновые волокна. Под данным слоем располагается зона частичной деминерализации, а затем дентин, не затронутый кондиционером.

Новая концепция в гибридизации Bromelain Enzyme для депротеинизации дентина перед нанесением адгезивной системы

Исследования с применением высокого увеличения показали, что бондинговые агенты, применяемые в настоящее время в качестве адгезивов, не способны полностью запечатывать поры дентина, образующиеся из-за действия кислоты. Размер пор измеряется в 10-50 нм. Ни водный мономер низкой вязкости, ни микроскопические реставрационные частицы не способны перекрыть эти поры. Тем не менее, дентин остается поврежденным и его когезивная стабильность после протравливания ничем не усиливается. Зоны с частичной деминерализацией дентина и микрополостями может считаться как слабое место для прикрепления. Схожие исследования по эмали показали отсутствие каких-либо респективных пор или пенетрационных дорожек.

До описания понятия микроподтека в 1994 было проведено множество исследований по изучению качества краевого прилегания пломбы с экспериментами по пенетрации красящих веществ. Целью являлось выявление краевых промежутков. Затем данные оценивались под обычным световым микроскопом. Лимитированные данные применяемых техник не позволили провести детализированный анализ гибридного слоя. Поэтому интерпретация экспериментов с проникновением красящих веществ и дифференциация между краевыми промежутками и феноменом микроподтека были затруднены, если не сказать невозможны. При таких условиях некоторые пломбировочные материалы считались «микроподтечными» только из-за проникновения краски через поры дентина при отсутствии краевых промежутков. Таким образом, данные эксперименты должны проводиться при лучшем техническом оснащении с различием отдельных путей пенетрации.

Недостатки в применении 10% раствора гипохлорита натрия для депротеинизации протравленного дентина, такие как формировании хрупкой зоны и цитотоксичность препарата, а также неприятный вкус и запах стали стимулом для разработки новой идеи в депротеинизации дентина.

Nd:YAG лазер является прекрасным хирургическим инструментом для коагуляции тканей, испарения и разреза. Активность лазера, как правило, концентрируется у пигментированных тканей. Сеть коллагеновых волокон имеет способность окрашиваться красителями. Таким образом, если частично деминерализованный дентин окрасить специальным селективным красителем для коллагеновых волокон, лазер Nd:YAG на специальных параметрах сможет селективно удалять коллаген без повреждения минеральных тканей.

Другой техникой по удалению коллагеновой сети служить использование ферментов, таких как коллагеназа или бромелайн.

Бромелайн – это белок, который действует как фермент и принадлежит к подклассу протеолитических ферментов (протеазы). Функция протеаз заключается в катализировании гидролиза белков с образованием аминокислот.

Целью данного исследования являлось сравнить различные способы удаления коллагеновых волокон: применение гипохлорида, Nd:YAG лазера и бромелайна, а также изучение микроподтека при каждом способе.

Материалы и методы

Подготовка образцов

Шестьдесят удаленных верхних премоляров без признаков кариозного поражения, пломбирований, трещин и очевидных дефектов были очищены и замочены в 50% этаноле при 8 градусах максимум на 1 месяц спустя удаление. Данная среда для хранения выбрана как наиболее стабильная по отношению к структуре дентина. Перед началом эксперимента зубы помещены в воду на 24 часа при температуре 20 градусов. Зубы рандомизированно разделены на две категории, 30 зубов использованы для сканирующей электронной микроскопии, а остальные 30 для изучения микроподтека.

Препарирование полостей

На лингвальной и щечной поверхностях отпрепарированы полости V класса (3 мм высотой, 3 мм шириной и 2 мм глубиной), используя турбинный наконечник под водяным охлаждением и алмазный бор средней зернистости №848 перпендикулярно к оси зуба. Границы полости помечены карандашом через матрицу с отверстием 3x3 мм, с размещением нижней границы полости по эмалево-цементному соединению.

Полость завершена шаровидным бором №2 на низкой скорости с водяным охлаждением. Скос эмали не производился.

В каждом исследовании зубы разделили на три группы по 10 зубов, отбор производился рандомизированно, оценка - независимо.

Группы, согласно способу депротеинизации

1. Группа 1: Кислотное протравливание и Nd:YAG лазер

Кондиционирование эмали и дентина:

Зубы подвергли полному протравливанию (37% фосфорная кислота), которая наносилась на край эмали и дентин на 15 секунд.

Полости тщательно промыты водой. Дентин подсушен воздухом в течение 2 секунд до слабой увлажненности поверхности (слабый блеск). Однако не следует оставлять количество воды, заметное визуально.

Применение Nd:YAG лазера:

Для удаление коллагенового слоя и образования «гибридного слоя» подготовлена окраска по Ван Гизону путем смешивания 1% водного раствора фуксина с насыщенным водным раствором пикриновой кислоты и дистиллированной воды. Тонкий слой красителя нанесен на полость при помощи аппликатора путем аккуратного втирания. К зубу применен Nd:YAG лазер в бесконтактном режиме с длинной волны 1064 нм 10 МДж тремя подходами с водяным охлаждением.

2. Группа 2: кислотное травление и фермент бромелайн

С данной группой проведена такая же процедура травления, как описано выше, затем нанесен бромелайн на протравленный дентин. Аппликация бромелайна проведена брашью в течение 1 минуты, затем остатки препарата смыты 5 мл дистиллированной водой.

3. Группа 3: кислотное травление и нанесение 10% NaOCl

Проведено кислотное травление эмали и дентина по описанной выше технике, затем нанесен 10% NaOCl. Раствор наносился брашью в течение 1 минуты, затем смыт 5 мл дистиллированной воды.

Нанесение бондингового агента

Для изучения микроподтека на кондиционированные структуры зуба нанесен Excite bond при помощи аппликатора. Раствор аккуратными движениями втирался в дентин в течение 10 секунд. Бонд оставлен на 10 секунд, остатки удалены струей воздуха. Бонд светоотвержден в течение 20 секунд.

Внесение пломбировочного материала

Для изучение микроподтека композитный материал (Solitaire, Heraeus Kulzer) был внесен в полость тремя слоями. Каждый слой светоотвержден в течение 20 секунд со всех сторон для полной полимеризации. Перед отверждением последнего слоя применена прозрачная матрица для контурирования реставрации. Края финированы и полированы при помощи полировочного диска.

Сканирующий электронный микроскоп

Сканирующая электронная микроскопия применена для выявления топографии субстрата дентина после депротеинизации протравленного дентина различными техниками. Десять зубов из каждой группы подготовлены для микроскопирования. Зубы распилены вдоль на две части, а затем изготовлены секционный срезы в 1 мм около полости при помощи низкоскоростного алмазного колесовидного бора с водяной системой охлаждения. Образцы подсушены струей воздуха и размещены в алюминиевом стенде. После напыления слоя золота в 40 нм аппаратом Balzers SCD050, стенки образцов исследованы при помощи электронного микроскопа Jeol 6100 с увеличением x2000. Данные позволили выявить субстрат дентина после различных техник депротеинизации.

Способность препятствовать микроподтеку

Зубы проверены под микроскопом на отсутствие фрагментов композита по всем краям. Апекс корня закрыт композитом Solitaire,а вся поверхность зуба, за исключением поверхности с бондом и прилегающих к ней 1мм, покрыта лаком для ногтей в 2 слоя. Затем зубы помещены в 50% раствор нитрата серебра в полной темноте на 24 часа, промыты под проточной водой 5 минут, опущены в раствор-проявитель и размещены под флюорисцентным светом на 8 часов. Зубы секционно распилены вдоль поверхности, покрытой бондом, таким образом, создавая 20 образцов. Все распилы размещены на стеклянной поверхности на адгезив. Все поверхности полированы алмазными пастами (3,1 нм) добиваясь толщины спила в 4 нм. Затем образцы покрыты покрывными стеклами. Исследование проводилось в поляризованном световом микроскопе. Микроподтек каждого образца оценивался как процент поверхности дентина, пропустившей нитрат серебра:

Уровень микроподтека = P/L x100

Где P = длина проникшего нитрата серебра вдоль материала/дентина и

L = общая длина стенки полости

Результаты

Исследование под электронным микроскопом

Фото 1 демонстрирует вид поверхности протравленного дентина под электронным микроскопом после применения Nd:YAG лазера. Обнаруживается весьма малое количество коллагена, покрывающего интертубулярный и перитубулярный дентин. Поверхность дентина выглядит микропористой схоже с мембраной лабиринта. Латеральные ответвления свободны от коллагеновых волокон.

Фото 1: микрофотография кислотно протравленного дентина с применением Nd:YAG лазера

Фото 2 демонстрирует вид поверхности протравленного дентина под электронным микроскопом после применения бромелайна в течение 1 минуты. Коллаген в интертубулярной и перитубулярном дентине полностью отсутствует. Перитубулярный дентин выглядит как лабиринт, латеральные ответвления которого свободны от коллагена. Входные отверстия трубочек выглядят шире, чем на фото после применения Nd:YAG лазера.

Фото 2: микрофотография кислотно протравленного дентина с применением фермента бромелайна.

Фото 3 демонстрирует вид поверхности протравленного дентина под электронным микроскопом после применения 10% NaOCl в течение 1 минуты. Сеть коллагеновых волокон хорошо просматривается в тубулярном и перитубулярном дентине. Отверстия трубочек не очищены.

Фото 3: микрофотография кислотно протравленного дентина после применения 10% NaOCl

Исследование наноподтека

Во всех образцах выявлен наноподтек, но разного уровня.

Фото 4 Среднее значение уровня микроподтека для каждой группы

В группе №2, где после протравливания применен бромелайн, световой микроскоп выявил наименьшее количество проникшего нитрата серебра. Под бондиноговой системой выявлена очень тонкая линия и всего несколько зон окраски серебра.

В группе 1, где был применен Nd:YAG лазер после кондиционирования, в световом микроскопе заметны сравнительно толстые полоски серебра, а также некоторые дентинные трубочки, полностью заполненные красителем.

В группе 3, где дентин обрабатывался 10% NaOCl, выявлена высокая пенетрация серебра. Красителем были также заполнены нижние участки полости.

Обсуждение

Продолжительность срока службы пломбы помимо всех факторов также зависит и от силы сцепления тканей зуба и пломбировочного материала. Было доказано, что создание интердиффузной зоны между деминерализированным дентином и материалом могут значительно снизить проникающую способность места соединения. Эта зона получила название гибридного слоя. Также изменения цвета края реставрации, рецидив кариеса, постоперативная чувствительность и выпадение пломбы являются следствием недостаточно или неправильно созданного гибридного слоя.

Большинство предыдущих исследований были проведены с целью определения микроподтека из-за образования щели между реставрацией и тканями зуба. Проникновение бактериальных продуктов, кислот и даже ротовой жидкости может считаться губительным для срока службы пломбы. Причинами этому может служить разрушение коллагена в процессе гидролиза. Garcia Godoy и Finger в 1993 показали, что при размещении реставрации в полости методы определения микроподтека не дают точной локализации дефекта в 75% случаев. Выявлено, что гибридный слой может быть проницаем для специальных красителей, таких как нитрат серебра. Чтобы различить этот тип подтека через гибридный слой от типичного микроподтека, который связан с образованием промежутка, Sano в 1995 представил вниманию термин «наноподтека». Проникновение в наноподтеке происходить через отверстия меньшие, чем 50 нм. Такие поры располагаются между необработанным дентином и поверхностной коллагеновой сетью.

Для количественной оценки наноподтека Sano предложил в 1995 применять нитрат серебра, который позволяет визуализировать глубину проникновения окраски через гибридный слой. Нитрат серебра является наиболее распространенным методом изучения подтека, позволяющим увидеть четкую картину проникновения красителя по краю реставрации. Gwinnett заявлял, что частично деминерализованный дентин, возможно, является самым важным морфологическим фактором в достижении оптимальной силы бондинга, а внешний коллагеновый слой не играет особой роли. Проницаемость этой зоны понижает силу сцепления и приводит к большему распространению красителя через нанометрические пространства. Как вывод эффект наноподтека обсуждается в качестве одного из негативных факторов, влияющих на качество бондинга.

Pashley в 1993 предложил определять микроподтек путем размещения флюорисцентой карски в пульповой камере удаленных зубов. Этот тест подтвердил проницаемость дентина к красящему веществу. Полученный данные имею прямое отношение к наноподтеку и предполагают возможные пути проницаемости в гибридном слое. Хотя механизм, приводящий к наноподтеку, до конца не выяснен, кажется очевидным, что феномен наблюдается во всех образцах по причине разной глубины протравливания и проникновения материала. Полученные данные также подтверждают предыдущие исследования, сообщающие о наличии проницаемости через гибридный слой.

Нанесение бромелайна на кондиционированный дентин значительно снижает общий показатель подтека. Это происходит по причине ликвидации коллагенового слоя на поверхности дентина и большему проникновению мономеров материала в поры тканей. Также удаление коллагеновой сети приводит к большему механическому сходству материала и дентина, минимизируя органический компонент дентина, и изменению гидрофильных свойств ткани. Такой же способностью в несколько меньшем качестве обладает и лазер Nd:YAG. Совсем малую эффективность в очистке дентина от коллагена показал раствор 10% NaOCl.

Данные результаты идут в разрез с исследованием Pioch 2010, который сообщал о снижении микроподтека при обработке кондиционированного дентина раствором 10% NaOCl. Но совпадают с данными Ferrari 2000, который не обнаружил способностей раствора гипохлорида снижать микроподтек и улучшать герметизацию. Первая и вторая группа образцов показала наименьшие значения микроподтека. Проницаемость при нанесении бромелайна была примерно в 4 раза меньше, чем при использовании лазера, и в 7 раз меньше, чем после обработки гипохлоридом.

Снижение количества коллагена на поверхности дентина приводит к:

1. Проницаемость дентина увеличивается. Через освободившиеся поры лучше проникает мономер материала. Сведения совпадают с Barbosa 1994 и Inaba 1995.

2. Очищенная поверхность дентина обладает большей энергией сцепления, так как гидроксиапатит является более благоприятной структурой для адгезии, нежели органическая матрица. Данные соответствуют исследованию Bedran de Castro 2000.

Дентин имеет пористую структуру и множество ответвлений, что также способствует высокой проницаемости мономера при пломбировании. Информация подтверждается в исследованиях Inai 1998 и Ferrari 2000.

Заключение

Мы пришли к выводу, что нанесение фермента бромелайн после протравливания дентина кислотой приводит к успешному удалению коллагеновой сети и значительному снижению микроподтека через адгезивную систему. Этап нанесения бромелайна является очень важным в достижении качественной адгезии и должен выполняться до аппликации бондингового агента.

Авторы: Raad Niama Dayem, BDS, MSc, PhD Conservative Dentistry, Michigan, Troy, USA
Mona A. Tameesh, BDS, Michigan, Troy, USA

0 комментариев

Только зарегистрированные пользователи могут оставлять комментарии.

Войти или Зарегистрироваться