Исследование условно-патогенных микроорганизмов методом ПЦР в реальном времени у больных пародонтитом

15 января 2012, 15:27

Полость рта человека населяют разные по видовому составу сообщества микроорганизмов. В их число входят как нормальная флора, так и условно-патогенные микроорганизмы, которые могут являться этиологическими агентами пародонтита. Количественное и качественное выявление ДНК основных пародонтопатогенов позволяет оценить степень дисбиотических нарушений микрофлоры ротовой полости, назначить адекватную терапию и оценить эффективность лечения.

Важная роль микробного фактора в этиологии и патогенезе воспалительных заболеваний пародонта определяет актуальность исследований в этом направлении.

Полость рта можно отнести к одному из идеальных для обитания микроорганизмов биотопов организма человека. Этот биотоп подразделяется на ряд суббиотопов с учетом анатомического строения и других особенностей отделов полости рта: десневую бороздку, язык, пародонтальный карман. Видовой состав микрофлоры этих суббиотопов напрямую зависит как от местных факторов защиты, так и от общих. К местным факторам можно отнести слюну и механизмы резистентности самой слизистой оболочки: фагоцитоз, выработка макрофагами и другими клетками биологически активных веществ, цитокинов.

Нормальная микрофлора ротовой полости играет не последнюю роль в защите организма человека от заболеваний. Практически у любого человека в полости рта, кроме ее естественных обитателей (нормофлоры, представленной лакто- и бифидобактериями), выявляются условно-патогенные и патогенные микроорганизмы.

Нарушение количественных соотношений между нормальной и условно-патогенной флорой приводит к развитию дисбиотических состояний и характеризуется снижением количества лакто- и бифидобактерий и ростом условно-патогенных микроорганизмов.

При пародонтите всегда имеют место дисбиотические нарушения. Доказано, что развитие пародонтита наиболее часто ассоциируется с увеличением количества и персистенцией в тканях пародонта Prevotella intermedia, Tannerella forsythensis, Treponema denticola, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis.

Основная трудность выявления указанных патогенов связана с проблемой культивирования анаэробных микроорганизмов и количественной оценкой результатов. Современные бактериологические лаборатории не всегда располагают необходимым оборудованием и питательными средами для культивирования облигатно-анаэробных микроорганизмов. В настоящее время в научных и практических исследованиях в области диагностики инфекционных заболеваний широкое распространение получил метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Использование ПЦР в реальном времени позволяет точно анализировать состав микрофлоры в десневой жидкости, зубной бляшке, слюне, выявляя ДНК искомых микроорганизмов в сложной смеси нуклеиновых кислот, а определение количества микроорганизмов обеспечивает возможность динамического наблюдения, что помогает адекватному выбору этиотропной терапии и оценке ее эффективности.

Целью настоящего исследования явилось выявление патогенных микроорганизмов в разных суббиотопах полости рта у больных пародонтитом и здоровых лиц методом ПЦР в реальном времени.

Материал и методы

ПЦР-диагностика десневой жидкости, зубных отложений, слюны проведена у 34 больных пародонтитом (20 женщин и 14 мужчин в возрасте от 27 до 65 лет) и 39 здоровых лиц (20 женщин и 19 мужчин в возрасте от 27 до 65 лет). Последние считали себя практически здоровыми, не имеющими сопутствующей патологии, полость рта у них была санирована, в тканях пародонта отсутствовали воспалительные изменения.

В группу больных пародонтитом вошли пациенты, не имевшие тяжелой фоновой патологии внутренних органов и систем, которая могла бы оказать заметное влияние на течение патологического процесса в пародонте. 62% из них обратились за помощью впервые, а 38% ранее лечились, за помощью обращались 1 раз в год. В зависимости от степени тяжести хронического генерализованного пародонтита их подразделили на 3 группы: с легкой степенью заболевания — 8 (23,5%) человек; со средней — 12 (35,3%); с тяжелым течением заболевания — 14 (41,2%).

Десневую жидкость для исследования отбирали с помощью стерильных бумажных полосок размером 0,3—0,8 мм,

одновременно в пробирку собирали слюну и стерильным ершиком снимали зубной налет.

ДНК для выявления микроорганизмов выделяли по методике «Проба-ГС» (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия) согласно прилагаемой инструкции. Метод основан на сорбции ДНК на органическом носителе, отмывке примесей с последующей элюцией нуклеиновых кислот с сорбента. ПЦР и определение температуры плавления олигонуклеотидных проб проводили с помощью детектирующего амплификатора «ДТ-96» (ООО «НПО ДНК-Технология»). Для оценки результатов использовали программное обеспечение, прилагающееся к детектирующему амплификатору «ДТ-96».

Для постановки ПЦР в реальном времени использовали реагенты ООО «НПО ДНК-Технология» согласно инструкции производителя.

После амплификации по показателю индикаторного цикла (Ct) рассчитывали количество ДНК исследуемого инфекционного агента. Для исключения ложноотрицательных результатов учитывали показатель амплификации геномной ДНК человека (контроль взятия биологического материала).

Результаты и обсуждение

Полученные данные представлены в табл. 1—4.

Таблица 1. Данные о микроорганизмах у больных пародонтитом легкой степени в разных биотопах полости рта (n=8)

Таблица 2. Данные о микроорганизмах у больных пародонтитом средней тяжести в разных биотопах полости рта (n=16)

Таблица 3. Данные о микроорганизмах у больных пародонтитом тяжелой степени в разных биотопах полости рта (n=10)

Таблица 4. Показатели у лиц со здоровым пародонтом (n=39)

Как видно из табл. 4, у здоровых людей в исследуемых средах — слюне, десневой жидкости, зубной бляшке — изучаемые микроорганизмы обнаруживали в единичных случаях. У больных пародонтитом в десневой жидкости, зубных отложениях и слюне отмечали повышение количества Pr. intermedia, P. gingivalis, T. forsythensis, Tr. denticola. Микроорганизм A. actinomycetemcomitans выявляли в единичных случаях. Количество P. gingivalis зависело от степени тяжести заболевания, у больных с тяжелым течением заболевания этот показатель был больше.

У большинства пациентов со здоровым пародонтом исследуемых микроорганизмов в десневой жидкости не

выявлялось, в зубных отложениях и слюне обнаруживали T. forsythensis в незначительных количествах.

В группе здоровых лиц в отдельных случаях наибольшее количество микроорганизмов обнаруживалось в зубных отложениях, но и в них их количество не превышало 10 в 6,4 степени ГЭ/образец (для T. forsythensis); других микроорганизмов было еще меньше.

В группе пациентов с пародонтитом легкой степени у большинства обследованных в десневой жидкости выявляли 3 микроорганизма: P. gingivalis (медиана — 10 в 4,4 ГЭ/образец), T. forsythensis (10 в 5,4 степени) и T. denticola (10 в 4,8 степени). В зубных отложениях и слюне были отмечены все микроорганизмы, кроме A. actinomycetemcomitans.

В зубных отложениях пациентов с пародонтитом средней степени тяжести выявлялись все 5 микроорганизмов, тогда как в десневой жидкости и слюне не обнаруживалось A. actinomycetemcomitans.

Самым высоким количество патогенных микроорганизмов у больных пародонтитом было в десневой жидкости и зубных отложениях (до 10 в 8 — 10 в 9 ГЭ/образец), в слюне оно было на 1—2 порядка ниже.

Группы здоровых лиц и больных со средней и тяжелой степенями пародонтита статистически значимо различались по количеству выявленных микроорганизмов. Здоровые и больные с легкой и средней степенями тяжести заболевания различались по количеству всех видов микроорганизмов в десневой жидкости; в зубных отложениях статистически значимо различались количества Pr.intermedia (р=0,0001), P. gingivalis (р=2,8х10 в —7 степени), T. forsythensis (p=l,6х10 в —6 степени) и Tr. denticola (p=3х10 в —5 степени), в слюне — P. gingivalis (p=0,0003) и T. forsythensis (p=0,01). Группа больных с тяжелой степенью пародонтита по исследуемым показателям статистически значимо отличалась от группы здоровых лиц по количеству всех выявляемых микроорганизмов в десневой жидкости и зубных отложениях, а в слюне были найдены достоверные различия между группами только по количеству P. gingivalis (р=8х10 в —5 степени), T. forsythensis (р=0,003) и Tr. denticola (р=1,6х10 в —4 степени). Таким образом, в качестве материала для исследования по 5 основным пародонтопатогенам наиболее репрезентативными являются зубные отложения и десневая жидкость.

На рис. 1 и 2 представлено количество микроорганизмов через 1 мес после лечения: снятие зубных отложений, противовоспалительная терапия, хирургический кюретаж.

Рис. 1. Количество выявляемых микроорганизмов у больных пародонтитом через 1 мес после лечения (десневая жидкость).

Рис. 2. Количество выявляемых микроорганизмов у больных пародонтитом через 1 мес после лечения (зубные отложения).

Исследованием установлены различия в снижении уровня микроорганизмов. В десневой жидкости после лечения выявлялась Tr. denticola, а в зубных отложениях — Pr. intermedia и P. gingivalis.

Полученные нами данные доказывают участие микроорганизмов зубной бляшки и других суббиотопов полости рта в развитии воспалительных заболеваний пародонта. Данная патология развивается на фоне изменения количества и качественного состава микрофлоры полости рта, что приводит к появлению и размножению условно-патогенной микрофлоры, вызывающей воспаление в пародонте.

Группы здоровых и больных достоверно различались по количеству 5 основных пародонтопатогенных микроорганизмов. По-видимому, для развития воспалительных заболеваний пародонта принципиальным является не только количество каждого конкретного условно-патогенного микроорганизма, но и число видов, принимающих участие в развитии патологического процесса. В качестве материала для исследования предпочтительны зубные отложения и десневая жидкость.

ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени — достаточно точный метод изучения количественного и качественного состава пародонтопатогенной микрофлоры ротовой полости. Исследование 5 пародонтопатогенных микроорганизмов в различных суббиотопах ротовой полости целесообразно проводить при выборе терапии и для оценки эффективности проведенного лечения.

Авторы:

д.м.н. Т.П. Иванюшко

к.биол.н. Л.В. Тумбинская

к.м.н. А.Е. Донников

0 комментариев

Только зарегистрированные пользователи могут оставлять комментарии.

Войти или Зарегистрироваться